Metilação do ADN
A metilação do DNA é um tipo de modificação química do ADN que pode ser herdada e subsequentemente removida, sem alterar a sequência original da molécula. Como tal, é interpretada pelo código epigenético e é também o mecanismo epigenético mais bem caracterizado.
Em células de vertebrados, a metilação de citosinas existe como um mecanismo pelo qual padrões de expressão gênica podem ser transmitidos para células-filha. A metilação de uma citosina não afeta o pareamento do nucleotídeo no duplex, e é análogo à relação entre timinas e uracilas. A transformação de citosina à 5-metilcitosina se dá por enzimas denominadas ADN metiltransferases - metilases, simplificadamente -, que podem promover a manutenção do padrão de metilação, garantindo sua herdabilidade após a replicação, ou introduzir metilações de novo durante o desenvolvimento embrionário. De modo geral, a metilação do ADN está associada à mecanismos de silenciamento genético. A existência de uma 5-metilcitosina ocupando a cavidade maior da dupla fita dificulta o acesso dos fatores de transcrição gerais, ou fatores regulatórios que dariam início à expressão do gene, reprimindo a síntese do mRNA correspondente. Soma-se a isso a existência de proteínas remodeladoras da cromatina que reconhecem as ilhas CpG metiladas no ADN e promovem alterações químicas nas histonas, induzindo a configuração de heterocromatina, silenciando um gene por modificações conformacionais do conjunto de nucleossomos.
ADN metiltransferases
A metiltransferase responsável pela manutenção do estado de metilação do ADN em humanos é a Dnmt1, que atua constitutivamente sobre a dupla fita hemimetilada, após a replicação. A Dnmt1 reconhece as regiões onde os dinucleotídeos CpG estão metilados na fita parental, e promove a metilação do carbono 5 da citosina na fita recém incorporada (pareada com G do CpG molde), garantindo assim a conservação do estado de metilação após a replicação, o que pode por exemplo, assegurar a manutenção das características de uma célula diferenciada. As ADN metiltransferases de novo tem como substrato as sequências não metiladas na dupla fita, e inserem um grupo metil na posição 5 das citosinas de uma das fitas. Em camundongos, foram identificadas duas metilases de novo: Dnmt3A e Dnmt3B, sendo que cada uma possui sítios alvos diferentes.
Ilhas CpG
A organização das ilhas CpG em mamíferos é devida ao funcionamento das enzimas de reparo de ADN e seus reflexos ao longo do tempo evolutivo. As 5-metilcitosinas tendem a ser excluídas do genoma pois, diferentemente das citosinas, quando sofrem uma desaminação não geram um componente estranho à molécula de ADN, e a mutação é transmitida pela replicação. O produto da desaminação de uma citosina é uma uracila, e por não compor a molécula de ADN normalmente, é reconhecida pela uracila ADN glicosilase, que a remove, e então uma nova citosina é inserida, concluindo o reparo da mutação. No entanto, quando uma 5-metilcitosina é desaminada, o produto da transformação é uma timina, gerando uma mutação indistinguível de algum outro resíduo do mesmo nucleotídeo. Durante a replicação, a T mutante será pareada com uma adenina, substituindo o antigo par C-G por um par T-A.
Acoplamento entre metilação das histonas e do ADN
Para loci silenciados, na conformação de heterocromatina, a metilação dos resíduos K9 das histonas H3 é diretamente relacionada à metilação dos dubletes CpG. Quando H3K9 se encontra metilada, sua afinidade por HP1 (Proteína 1 de Heterocromatina) é impulsionada, direcionando a associação da proteína remodeladora da cromatina à estrutura a ser silenciada. Na etapa seguinte, metilases do ADN (ADN Metiltransferases, DNMTs) são recrutadas e a expressão do gene é ainda mais atenuada. A metilação de H3K9 e do ADN são processos sinérgicos que culminam no silenciamento gênico, onde um resíduo de aminoácido metilado sinaliza para a atividade de DNMTs, e dinucleotídeos CG metilados promovem a atividade de histonas deacetilases e metilases. O sistema de silenciamento gênico por metilação é altamente conservado em fungos, plantas e células animais, modulando a taxa de transcrição de genes processados pelas RNA polimerases I e II, e mantendo a heterocromatinas constitucionais do genoma.
Os primeiros métodos para detectar metilação do ADN forneciam informações pouco específicas, como nível total de metilação no genoma, ou a proporção entre citosinas metiladas e não metiladas em determinados sítios de restrição. O surgimento de novas tecnologias de sequenciamento possibilitou a análise de padrões de metilação no genoma total de organismos com resolução de pares de bases individuais. As técnicas são diversas e existem numerosos protocolos disponíveis, cada um com vantagens e limitações; a escolha apropriada depende das particularidades do genoma a ser analisado e do objetivo final. Os protocolos, em geral, requerem um pré-tratamento que permita distinção entre citosinas metiladas e não metiladas. Os principais são digestão por endonucleases, conversão por bissulfito e métodos baseados em enriquecimento por afinidade. A seguir serão brevemente descritos os pré-tratamentos e métodos de sequenciamento e hibridização.
Digestão por endonucleases
As endonucleases de restrição, ou enzimas de restrição, clivam o DNA em sítios específicos, e algumas delas são inibidas por metilação da citosina em regiões CpG. Os cortes resultantes, portanto, fornecem informações sobre os padrões de metilação. A análise pode ser feita através de amplificação por PCR e eletroforese em gel, ou hibridização em Southern Blot .
Conversão por Bissulfito
O bissulfito de sódio converte citosinas não metiladas de dinucleotídeos CpG em uracila, enquanto as citosinas metiladas permanecem inalteradas. Algumas técnicas que podem ser utilizadas para detecção de metilação após o tratamento com bissulfito são clonagem e sequenciamento, sequenciamento direto e espectrometria de massas.
Enriquecimento por afinidade
MeDIP (Imunoprecipitação de DNA metilado) e MIRA (Ensaio de recuperação de ilhas CpG metiladas) são técnicas baseadas em imunoprecipitação. MeDIP consiste na utilização de anticorpos específicos para citosinas metiladas, que ligam apenas em DNA de fita simples. O DNA é, então, hibridizado em microarranjos de DNA (DNA microarray). MIRA utiliza o complexo proteico MBD2b/MBD3L1, que tem alta afinidade por trechos CpG metilados em DNA de dupla fita.
Análise de metilação global
Hidrólise do DNA, desoxirribonucleosídeos separados por HPLC, identificação de bases por absorbância. Maior especificidade pode ser alcançada acoplando HPLC com espectrômetro de massas. Enzima de restrição cliva sítios CCGG, independentemente de metilação. Marcação do fosfato 5’ da citosina, hidrólise do DNA em mononucleotídeos, separação em camada delgada de celulose. Citosinas metiladas e não metiladas têm diferentes fatores de retenção e, portanto, estarão em pontos diferentes. A intensidade relativa dos pontos (revelada pela marcação do fosfato) revela a proporção entre sítios metilados e não metilados no genoma. A enzima adiciona um grupo metil radioativo em todos os trechos CpG não metilados no genoma. Quanto mais radioativa a amostra, menos sítios CpG estavam originalmente metilados.
Análise de metilação gene-específica
Microarranjos consistem em um suporte sólido contendo pontos com sequências específicas de DNA. Sequências complementares na amostra analisada se ligam à essas moléculas e, quanto mais bases complementares, mais forte é a ligação. É feita uma lavagem para remoção de hibridizações não específicas, e restam apenas as moléculas fortemente associadas. As ligações podem ser detectadas por fluorescência. Essa técnica é frequentemente combinada com métodos enzimáticos (endonucleases) e de enriquecimento por afinidade. Não é muito adequada para análise de DNA tratado com bissulfito, já que, exceto pelas citosinas metiladas, o DNA consiste em apenas 3 bases, o que aumenta redundâncias na sequência e diminui a especificidade da hibridização.
Metilação do DNA e envelhecimento
A quantidade de regiões CpGs metiladas do genoma de humanos vem sendo recentemente utilizada como biomarcador para envelhecimento. Diferentes conjuntos de regiões metiladas são usadas para criar relógios epigenéticos que servem para estimar, com alta precisão (r>0.8), a idade de certas células e tecidos. Existem hoje diversos modelos de relógios epigenéticos como, por exemplo, o relógio de Horvarth, relógio de Hannum e relógio de Levine, cada um desses relógios têm melhor precisão quando aplicados à análise de um tipo ou conjunto de células específico. Embora seja um método que demonstre alto poder de previsibilidade do envelhecimento e até da longevidade e possíveis causas de morte, ainda não se sabe ao certo se os níveis de metilação são causa ou produto do envelhecimento.
Metilação e câncer
Diversos estudos mostram alta correlação entre desregulação dos níveis de metilação do DNA e a presença de tumores e cânceres. Embora os níveis estejam alterados nas células e tecidos cancerosos, os efeitos funcionais desses fatores ainda não foram completamente elucidados. Alterações nos níveis de metilação de ilhas CpGs de promotores, metilação de genes relacionados ao reparo do DNA e metilação de genes relacionados à microRNAs já foram demonstrados, em diversos estudos, como possíveis envolvidos no desenvolvimento de câncer. Tanto hipermetilação quanto hipometilação de regiões do genoma parecem estar ligadas à presença de câncer. É proposto que a hipermetilação possa facilitar o desenvolvimento de câncer ao silenciar genes supressores de tumores, fazendo com que fenótipos cancerosos tenham menor resistência dos mecanismos de defesa celulares intrínsecos e, de maneira mais global, do sistema imunológico. Já a hipometilação impediria que genes oncogênicos fossem devidamente silenciados, facilitando o desenvolvimento de quadros cancerosos. Esses dados apontam que a relação entre metilação e câncer seria causada pela instabilidade no funcionamento dos mecanismos de silenciamento genético, o que levaria à desregulação de genes envolvidos no controle de fatores relacionados ao desenvolvimento de câncer.
Nos últimos anos cientistas vêm juntando esforços para criar “metilomas”, algo como bancos de dados para o reconhecimento e aferimento de regiões contendo pontos característicos de metilação do DNA e seus possíveis efeitos nos organismos. Esses metilomas vem sendo propostos há bastante tempo, mas só com os recentes avanços nos métodos de sequenciamento genético se tornaram alcançáveis. Em 2011 foi criado o IHEC (International Human Epigenome Consortium), um grupo de cientistas que tem como foco prover mapas do epigenoma humano em alta resolução e de acesso livre para a comunidade acadêmica, o IHEC tem como objetivo a criação de 1000 mapas epigenômicos até 2020. O grupo também trabalha no desenvolvimento das técnicas de criação e análise de dados epigenéticos, coordenando esforços para impedir a redundância entre as pesquisas, buscando alcançar dados de alta qualidade da maneira mais eficiente possível.
Existem diferenças nos padrões de metilação entre os organismos. O grupo dos vertebrados mostram taxas de aproximadamente 60~80% de ilhas CpGs metiladas em células somáticas. Enquanto que outros grupos como os dos invertebrados, plantas e protozoários geralmente apresentam metilações pontuais no genoma, que teriam como alvo elementos genômicos específicos. Em organismos modelo como Drosophila melanogaster as taxas de metilação são baixíssimas. Análises de metilação no DNA de Drosophilas encontraram apenas 0,3-0,4% do total de citosinas do DNA metilado. Estudos recentes mostraram que grande parte da metilação durante as fases do desenvolvimento embrionário de Drosophilas ocorrem em regiões limitadas do genoma (equivalente a aproximadamente 1% do total) que apresentam quantidade elevada de sequências CA- e CT- sem a presença de guanina. Metilação de ilhas CpG foram reportadas em abelhas (Apis melifera), presentes geralmente nas sequências do corpo dos genes. Essas metilações são propostas como responsáveis por mecanismos de controle genético relacionados ao splicing alternativo nesses animais.
