Recombinação homóloga
A recombinação homóloga é um tipo de recombinação genética, assim como a Recombinação Sítio-Específica e a Transposição, das quais se distingue pois é um fenômeno de troca de material genético a nível molecular que ocorre entre sequências precisamente correspondentes, de modo que nenhum par de bases é adicionado ou perdido durante o processo, ou seja, que carregam informações homólogas sem perdas ou ganhos de informação.
Em 1856, o monge Gregor Johann Mendel iniciou experimentos de cruzamento seletivo em plantas de ervilhas, Pisum sativum, para observar a hereditariedade de seus caracteres de geração em geração, como: a textura (lisa ou rugosa), a cor (verde ou amarela), a altura e a coloração das flores, em seu trabalho essas características são citadas como “fatores discretos”, e posteriormente foram denominadas por Wilhelm Johannsen em 1909 como “genes”. Mendel não foi o único botânico de sua época a realizar experimentos quanto a da reprodução de plantas, muitos outros também foram instigados a realizar o mesmo a partir da afirmativa do botânico Nehemiah Grew de que através do pólen que determinados vegetais se reproduzem sexualmente. Após diversos cruzamentos, a anotação e triagem de seus resultados, Mendel foi capaz de descrever certos fenômenos, conhecidos como as “Leis da Hereditariedade”, como: dominância e recessividade, homozigoto e heterozigoto, segregação independente, e casos específicos, como as formas híbridas peculiares. Assim, Gregor Mendel formulou os princípios da hereditariedade, se consagrando em 1900 como “pai da genética moderna” após ter seus estudos redescobertos por três estudiosos europeus da época, Carl F. J. E Correns, Hugo M. de Vries e Erich von Tschermak-Seysenegg, tornando-se base para os estudos dos mesmos.
O modelo mais aceito para explicar a recombinação homóloga é o Modelo de Reparo por Quebra de Dupla Fita (DSBR — Double-Strand Break Repair). O processo é iniciado por uma quebra em uma das moléculas de DNA e prossegue com a troca de fitas, conforme ilustrado nas figuras originais.
A recombinação homóloga (HR) começa com uma quebra de dupla fita (DSBs). O primeiro passo é processar essa quebra para criar as extremidades de fita simples (ssDNA) necessárias para buscar por homologia. A recombinação homóloga (HR - homologous recombination) é um mecanismo refinado fundamental para manutenção dos organismos para além de sua função principal, que é a troca de material genético entre sequências homólogas. A evolução, mutação, e replicação, reparo e manutenção do DNA (deoxyribonucleic acid), etc, se relacionam à recombinação homóloga em algum ponto de seus processos, porém a recombinação homóloga também está relacionada a eventos de instabilidade no genoma, ocasionando repercussões negativas à saúde do organismo, como o câncer. A recombinação homóloga (HR) atua no reparo de quebras de cadeia dupla de DNA (DSBs - DNA double-strand breaks), ligações cruzadas entre fitas (ICLs - interstrand crosslink) e lacunas de DNA, na geração de diversidade genética na meiose (via segregação independente e crossing-over), na segurança da segregação cromossômica (descarte de recombinações desfavoráveis), restaurando forquilhas de replicação de DNA (manutenção da replicação), e entre outras funções. Entretanto, a mutação do gene BRCA2, gene associado a supressão de cânceres, pode causar a deficiência da recombinação homóloga (HRD - homologous recombination deficiency) que leva ao desequilíbrio do mecanismo de replicação do DNA levando ao aumento de mutações. O comprometimento das vias de reparo do DNA por recombinação homóloga (HR) pode levar aos cânceres de próstata, ovário, mama e pâncreas.
Quebras de dupla fita de DNA — causadas por problemas de forquilha, recombinação ou químicos e radiação iônica — são consideradas como fonte de estresse no processo de duplicação, sendo barreiras físicas que atrapalham o funcionamento da forquilha de replicação, as induzindo ao colapso, aumentando as chances de mutações e o acúmulo de ssDNA — DNA que foi solto porém não copiado. Duas das soluções primárias para lidar com o estresse é o método de ligação de extremidades não homólogas (NHEJ), modo rápido e propenso a erros onde a união é feita diretamente das quebras, e a recombinação homóloga, uma forma segura usando o cromossomo homólogo como molde, com a associação de componentes como proteínas de RAD51, BRCA1 e BRCA2, que são de extrema importância para o bom funcionamento da recuperação da fita e suas deficiências são frequentemente associadas a doenças. O modelo atualmente aceito de explicação do processo é o de Szostak et al. (1983), que propõe que a reparação da dupla fita é realizada iniciando na detecção da quebra pelo complexo MRN, que detecta as extremidades danificadas e faz o recrutamento de proteínas como o ATM, que, por sua vez, faz a ativação de outras proteínas para lidar com o dano, entre elas a BRCA1. Uma das partes do MRN, a Mre11, também realiza “cortes” nas pontas, deixando-as livres de empecilhos para um melhor reparo.
A geração de diversidade genética na meiose é um processo ligado a recombinação meiótica, no qual fornece uma evolução e sobrevivência de espécies que fazem reprodução assexuada. À princípio tal recombinação origina um produto meiótico através de novas combinações dos alelos que foram levados pelos genótipos haploides e que se uniram para formar o meiócito (a célula diploide que sofre meiose). Tanto a recombinação quanto a diversidade genética dependem de duas fases importantes: segregação independente de cromossomos e o crossing over.
Segregação independente (segundo Mendel):
Mendel tentou explicar um mecanismo biológico, o que veio a se tornar a Segregação Independente ou 2º Lei de Mendel, através de testes com cruzamento de ervilhas. Ele concluiu que diferentes pares de genes se distribuem independentemente durante a formação dos gametas. A segregação independente de pares de genes localizados em diferentes cromossomos é totalmente explicada pelo comportamento dos cromossomos durante a meiose. Todo o processo começa com a organização das moléculas de DNA, onde o cromossomo é criado. O ponto-chave da atuação dos cromossomos está na fase Metáfase I — em que os cromossomos homólogos se alinham na placa metafásica e estabelecem a base física para a segregação independente — e na fase Anáfase I — onde os pares de cromossomos homólogos se separam (evento chamado disjunção dos homólogos) e se movem em direção aos polos opostos da célula, contribuindo para a variação genética dentro da segregação.
Crossing over:
O crossing over é uma característica fundamental na meiose, pois gera a recombinação de genes ligados ao mesmo cromossomo, essencial para a garantia e melhoria da variação genética. Nele ocorrem alguns processos como a Quebra do Filamento Duplo (DSBs) (primeiro evento tanto para o reparo de DNA quanto para o crossover meiótico), Erosão das Extremidades (depois da quebra a célula erodi/destrói as extremidades 5’ do DNA, deixando ambas as extremidades 3’ expostas em filamentos simples), Invasão do Filamento e Reconhecimento Homólogo (um filamento exposto se liga a um cromossomo homólogo vizinho que o complete), Síntese de DNA e Formação de Heteroduplex (a ponta 3' livre do filamento exposto utiliza o DNA invadido como molde para iniciar a síntese de um novo DNA, porém pode ocorrer o que chamamos de heteroduplex — quando uma molécula de DNA tem um par de nucleotídeos incorretamente pareados) e Resolução e Crossover Final (a síntese de DNA preenche os espaços, e os filamentos são selados, resultando em uma estrutura peculiar com duas junções de filamento simples, chamadas junções de Holliday). A formação final desse processo é o quiasma (estrutura em formato de cruz), crucial para manter os cromossomos homólogos conectados e estabilizados.
Segurança na segregação cromossômica:
A segurança na segregação cromossômica é crucial a partir do momento em que a sua falha leva a anomalias no número ou na estrutura dos cromossomos, resultando em distúrbios/doenças. A segurança é garantida por mecanismos celulares da divisão das células somáticas (mitose) e da formação dos gametas (meiose). A importância desse processo para o crescimento celular normal é ilustrada pela observação de que muitos tumores são caracterizados por um estado de desequilíbrio genético resultante de erros mitóticos na distribuição dos cromossomos para as células-filhas. No crossing over, como mostrado, os segmentos homólogos de DNA são trocados entre as cromátides não irmãs (não idênticas) de um par de cromossomos homólogos, garantindo assim que nenhum dos gametas produzidos pela meiose seja idêntico ao outro. A aneuploidia, por exemplo, é uma não disjunção cromossômica (na qual dois cromossomos ou duas cromátides vão para um polo e não para outro) que pode ocasionar um distúrbio cromossômico no autossomo inteiro: trissomia do 21 (Síndrome de Down), além de outros. Por isso, o crossover é importante para a manutenção do pareamento, evitando esses erros nas ligações gênicas.
Geração de diversidade em células B:
A diversidade dos linfócitos B é gerada pela recombinação V(D)J, um tipo específico de recombinação somática que utiliza enzimas especializadas denominadas recombinase V(D)J, que reconhece as sequências sinal de recombinação no DNA que ataca cada segmento gênico que deve ser unido. (ALBERTS, 2017, p.1320). A perda e o ganho de nucleotídeos aleatórios, que ocorre na V(D)J, nos locais de união, são denominados diversificação juncional, e em muitos casos, isso desloca a fase de leitura, produzindo genes não funcionais e, nesse caso, a célula B falha na produção de uma molécula de imunoglobulina funcional e, como consequência, morre na medula óssea.
Câncer.
O câncer é uma doença originada do excesso de mutações celulares, causadas por instabilidade genômica, que afetam seu funcionamento, divisão e outros, onde a célula afetada adquire vantagem em proliferação e se espalha rapidamente pelos tecidos do corpo. Essa instabilidade se origina por defeitos genéticos em, principalmente, BRCA1 e BRCA2, já que, sem recrutamento ou posicionamento de proteínas essenciais para o reparo de quebras, os métodos de reparo principal passam a ser a junção de extremidades não homóloga, o que acumula sequências errôneas ao longo das divisões. O p53 é um supressor tumoral que protege o genoma, induzindo o reparo celular ou apoptose caso o dano ao DNA aconteça. Essa proteína é de extrema importância no processo imune antitumoral e está ligada ao funcionamento da BRCA1, pois a BRCA1 serve como um sensor de dano, que ativa e estabiliza p53 e seu funcionamento. Quando há ausência desse sensor de dano, o p53 não tem fosforilação e não realiza o controle do reparo, causando danos letais à instabilidade genômica. Outro ponto é que os BRCA são associados a casos de câncer com base hereditária de heterozigose, a manutenção de telômeros e a diversidade genética presente nos tumores, o que adiciona ainda mais aos perigos da mutação do grupo BRCA.
Trissomia 21
A Síndrome de Down é uma condição onde há a presença de um cromossomo extra nas células do corpo, totalizando 47 no total. Através de uma pesquisa realizada em 2023, que buscava entender a pré-disposição precoce de leucemia por pessoas com trissomia 21, mostrou que as células sanguíneas do grupo são naturalmente mais instáveis. Essa instabilidade celular foi associada ao gene DYRK1A, do cromossomo 21 — logo, super expressa em T21 —, que diminui a recombinação homóloga e, igualmente, forçando o corpo a seguir por caminhos como a ligação não homóloga para reparos. Outro trabalho também mostra que, conforme o tempo, a capacidade de separação cromossômica diminui, prejudicando a recombinação genética homóloga, ocasionando em más recombinações e em não disjunção, a principal causa da T21.
O uso de recombinação homóloga no tratamento de doenças é de extrema importância e relevância, pois se utiliza de uma parte já proveniente do paciente, sendo ela modificada de modo que o necessário se muta, o restante se mantém igual, sem riscos, e a recuperação da modificação é feita sem altas chances de dano mutagênico e garantindo a eficácia do tratamento.
Terapia gênica.
A recombinação homóloga é usada de forma terapêutica em tratamentos por terapia gênica de diversas doenças, sendo alternativas essenciais para condições como anemia falciforme, uma doença causada por mutação de hemoglobina. Nesse caso, seu tratamento é comumente feito por terapia gênica por lentivírus, porém, pesquisas em que foi testado o método por recombinação homóloga com células-tronco embrionárias se mostraram muito mais eficazes e sem riscos de mutagênese. A escolha dos componentes do tratamento são sempre semelhante e acontece pois, além de evitar mutagênicos devido ao lentivirus, a recombinação homóloga permite a correção do que é necessário, mas preservando o controle natural do gene, enquanto as células-tronco podem ser manipuladas e depois inseridas novamente. Por isso, mesmo a ação da recombinação em alguns casos, como em células hematopoiéticas, não sendo tão funcional, ainda são pesquisados e utilizados métodos que melhorem sua eficácia para seu uso regular.
Edição gênica.
A edição gênica é uma tecnologia onde se pode alterar o DNA de um indivíduo, seja para retirar, adicionar ou mudar a expressão de genes, com o uso principal focado em medicina. Seu principal sistema de edição atual é o CRISPR-Cas9, que utiliza um RNA (ribonucleic acid) guia, que serve para encaminhar a enzima editora, a Cas9, até o gene desejado. Um dos principais problemas apresentados no sistema é uma boa probabilidade de que, após os cortes, as fitas se juntem por junção de extremidades não homólogas, criando mutações e impedindo que o gene drive — mecanismo que força a propagação de um gene específico — siga para as próximas gerações e, logo, que a edição seja eficaz.
