Reparo de ADN
Reparação de ADN é um conjunto de processos pela qual a célula identifica e corrige os danos das moléculas de DNA que codificam o seu genoma. Em células humanas, tanto atividades metabólicas normais quanto fatores ambientais podem causar danos no ADN, resultando em cerca de 1 000 000 lesões moleculares individuais por dia. Muitas dessas lesões causam danos estruturais à molécula de ADN e podem alterar ou eliminar a habilidade celular para transcrição gênica. Outras lesões provocam mutações potencialmente prejudiciais no genoma celular, que afetam a sobrevivência de suas células irmãs que depois sofrem mitose. Como consequência, o processo de reparo de ADN precisa estar funcionando constantemente para resolver rapidamente os danos na estrutura do ADN.
Os danos no ADN, devidos aos fatores ambientais e dos processos metabólicos celulares normais, ocorrem a uma taxa de 10 000 a 1 000 000 lesões por célula diariamente. Ainda assim, várias outras fontes de danos podem elevar ainda mais essa taxa. Enquanto isso constitui apenas 0,000165% do genoma humano, 3 000 000 000 (3 bilhões) de bases, uma única lesão não reparada em um gene relacionado ao câncer (como o gene supressor de tumor) pode ter consequências catastróficas ao indivíduo. A maioria dos danos no ADN afectam a estrutura primária da dupla-hélice; isto é, as próprias bases são modificadas quimicamente. Estas modificações podem, por sua vez, alterar a estrutura helicoidal das moléculas ao introduzir ligações químicas não nativas ou adutos volumosos que não se encaixam bem na estrutura da dupla-hélice padrão. O ADN está superenrolado e associado a proteínas de "empaquetamento" chamadas histonas (em eucariotas), e ambas as estruturas são vulneráveis aos efeitos dos danos no ADN, e devem ser reparadas. A própria modificação de histonas faz parte dos mecanismos de reconhecimento dos danos e reparação do ADN.
Danos no DNA nuclear (nDNA) versus danos no DNA mitocondrial (mDNA)
Em humanos, e células eucarióticas em geral, o DNA é encontrado em duas localidades na célula: no núcleo (nDNA) e dentro das mitocôndrias. DNA nuclear existe em larga escala em estruturas agregadas conhecidas como cromossomos, os quais são compostos de DNA e, envolvidas por proteínas chamadas histonas. Sempre que a célula precisa expressar a informação genética codificada no nDNA é requerida uma região cromossômica não-revelada, genes localizados lá são expressos e a região é condensada de volta a conformação quiescente. O DNA mitocondrial (mtDNA) é localizado dentro da mitocôndria; existem em múltiplas cópias e isso é também fortemente associado com o número de proteínas para formar um complexo conhecido como nucleoide. Dentro da mitocôndria, espécies reativas de oxigênio (ERO) ou radicais livres, são produtos da constante produção de trifosfato de adenosina (ATP) via fosforilação oxidativa, criam um ambiente altamente oxidativo que é conhecido por danos no mtDNA.
Fontes de danos
Os danos no ADN podem ser divididos em dois tipos principais: A replicação do ADN danificado antes da divisão celular pode causar a incorporação de bases incorretas na cadeia complementar do ADN em frente das bases danificadas. As células-filhas que herdam estas bases incorretas carregam mutações, pelo que a sequência de ADN original é irrecuperável, exceto no raro caso de ocorrer uma mutação retrógrada (isto é, uma mutação pontual que restaura a sequência original e, portanto, o fenótipo original), por exemplo por conversão génica.
Tipos de dano
Há vários tipos de danos no ADN devidos a processos celulares endógenos:
Danos no ADN nuclear e mitocondrial
Nas células humanas, e, em geral, nas células eucariotas, o ADN encontra-se em duas localizações celulares: dentro do núcleo e dentro das mitocôndrias. O ADN nuclear (ADNn) está na forma de cromatina durante os estados não replicativos do ciclo celular e condensa-se em estruturas agregadas chamadas cromossomas durante a divisão celular. Em ambos os estados o ADN está muito compactado e enrolado à volta de grupos de proteínas histonas. Quando uma célula precisa de expressar a informação genética codificada no seu ADNn, a região cromatínica envolvida é desenrolada, e os genes localizados ali são expressos, e depois a região volta a condensar-se à sua conformação anterior. O ADN mitocondrial (ADNmt) está localizado dentro das mitocôndrias, é circular e bicatenário, dele há muitas cópias, e também está estreitamente associado com várias proteínas com as quais forma um complexo chamado nucleoide. Dentro da mitocôndria as espécies reativas do oxigénio (ROS), ou radicais livres, que são subprodutos da constante formação de ATP por fosforilação oxidativa, criam um ambiente muito oxidante que se sabe produzir danos no ADNmt. Uma enzima fundamental para contrariar a toxicidade destas espécies é a superóxido dismutase, a qual está presente tanto em mitocôndrias como no citoplasma das células eucariotas.
Senescência e apoptose
A senescência, que é um processo irreversível no qual a célula já não se divide, é uma resposta protetora ao encurtamento dos telómeros (extremos cromossómicos). Os telómeros são longas regiões formadas por ADN não codificante repetitivo que formam uma espécie de topo no extremo dos cromossomas, mas que sofrem uma degradação parcial (pelo que se encurtam) cada vez que a célula se divide (ver limite de Hayflick). O estado de quiescência é um estado irreversível de dormência celular que não está relacionado com danos no ADN (ver ciclo celular). A senescência nas células pode servir como uma alternativa funcional à apoptose em casos onde é necessária a presença física de uma célula por razões espaciais para o organismo, o qual serve como mecanismo de "último recurso" para impedir que uma célula com ADN danificado se replique inapropriadamente na ausência de uma sinalização celular que indique crescimento. As divisões celulares não reguladas podem levar à formação de um tumor (ver cancro), potencialmente mortal para o organismo. Portanto, a indução da senescência e a apoptose é considerada parte de uma estratégia de proteção contra o cancro.
Danos ao DNA e mutação
É importante distinguir entre os danos de DNA e mutação, os dois principais tipos de erros no DNA, pois são fundamentalmente diferentes. Os danos são anormalidades físicas na molécula, como as quebras das ligações simples e duplas, os resíduos de 8’-oxo-deoxiguanosina e adutos de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos. Eles podem ser causados pela recodificação por enzimas, e, também, eles podem ser corretamente reparados se a informação redundante, como as sequências não danificadas na extremidade dos complementos de DNA ou em um cromossomo homólogo, é disponível para cópia. Se a célula retém os danos de DNA, a transcrição do gene pode ser evitada, e, também, a tradução dentro da proteína pode também ser bloqueada. A replicação pode também ser bloqueada ou a célula pode morrer.
Células não podem tolerar danos no DNA que comprometam a integridade e a acessibilidade das informações essenciais do genoma (mas, células permanecem superficialmente funcionais quando os então chamados genes não-essenciais são perdidos ou danificados.). Dependendo do tipo de dano infligido na estrutura duplo-helicoidal de DNA, uma variedade de estratégias de reparo tem sido envolvidos para restaurar informações perdidas. Como modelos de restauração, as células utilizam uma fita complementar não modificada de DNA ou do cromossoma-irmão. Sem acesso a informação modelo, o reparo de DNA é propenso a erros (mas isso pode ser uma via padrão: muitos danos na fita dupla nas células de mamíferos, e.g: são reparados sem ajuda de um modelo; ver mais adiante). Os danos no DNA alteram a configuração espacial da hélice e tais alterações podem ser detectadas pela célula. Uma vez o dano seja localizado, moléculas específicas de reparo de DNA são enviadas ao local e se ligam à região ou nas proximidades do local do dano, incluindo outras moléculas para ligar e formar um complexo que habilita o reparo a agir no local. Os tipos de moléculas envolvidas e o mecanismo de reparo que é mobilizado depende:
Danos à fita simples
Quando somente uma das duas fitas de dupla hélice tem defeito, a outra fita pode ser usada como modelo para guiar a correção da fita danificada. Para reparar os danos de uma das duas febras emparelhadas do ADN, existem vários mecanismos de reparação por excisão que removem o nucleótido danificado e o substituem por outro nucleótido correto que seja complementar ao que se encontra na febra do ADN não alterada. Estes mecanismos são:
Quebras de dupla fita
As quebras de dupla fita (em português, QDFs), nas quais num ponto há um corte que afeta ambas as fitas da dupla hélice, são especialmente perigosas para a célula porque podem originar rearranjos genómicos. Há três mecanismos que reparam as quebras de dupla fita (em inglês DSBs): união de extremidade não-homóloga (em inglês NHEJ), união de extremidades mediada por microhomologia (em inglês MMEJ) e recombinação homóloga. O investigador P. V. Acharya assinalou que as quebras de dupla fita e uma "ligação por ligações cruzadas que ligue ambas as fitas no mesmo ponto é irreparável porque nenhuma das fitas pode servir como molde para fazer o reparo. A célula morrerá na seguinte mitose ou em raros casos, mutará."
Síntese translesão
A síntese translesão (TLS) é um processo que permite tolerar danos no ADN para que a maquinaria de replicação do ADN possa replicar para lá dos pontos onde há lesão no ADN, como dímeros de timina ou sítios AP. Funciona trocando as ADN polimerases normais por polimerases translesão especializadas (isto é, as ADN polimerases IV ou V, pertencentes à família de polimerases Y), que costumam ter sítios ativos maiores que podem facilitar a inserção de bases situadas em frente de nucleótidos danados. Esta troca de polimerases crê-se que é mediada, entre outros fatores, pela modificação pós-traducional do fator de processividade da replicação PCNA. As polimerases de síntese translesão costumam ter uma baixa fidelidade (alta propensão a inserir bases erradas) ao copiarem moldes não danados em relação às polimerases normais. Contudo, muitas são extremamente eficazes na hora de inserir as bases corretas em frente aos locais onde há tipos específicos de danos. Por exemplo, a Pol η (eta) realiza um contorno ou bypass livre de erros de lesões induzidas por irradiação ultravioleta, enquanto que a Pol ι (iota) introduz mutações nesses sítios. A Pol η adiciona a primeira adenina por meio do fotodímero T^T usando emparelhamentos de bases de Watson e Crick e a segunda adenina é adicionada na sua conformação syn usando emparelhamento de bases de Hoogsteen.
As células expostas à radiação ionizante, raios ultravioleta ou a certos compostos químicos sofrem em muitos locais do seu ADN lesões volumosas e quebras de dupla febra. Além disso, os agentes que danificam o ADN podem danificar também outras moléculas como proteínas, carboidratos, lípidos e ARN. A acumulação de danos, especificamente de quebras de dupla febra ou adutos do ADN que fazem com que a forcada de replicação fique parada, estão entre os sinais estimuladores que se sabe desencadearem uma resposta global aos danos no ADN. A resposta global aos danos é uma ação dirigida à preservação das próprias células e ativa muitas vias de reparação macromolecular, contorno dos pontos lesionados, tolerância, ou apoptose. As características comuns da resposta global são a indução de muitos genes, a paragem do ciclo celular e a inibição da mitose. Certos genes são conhecidos por influenciar a variação na expectativa de vida de uma população de organismos. Estudos em organismos-modelos como leveduras, vermes, moscas e ratos têm identificado genes simples, os quais quando modificados, poderiam dobrar a expectativa de vida (e.g.: uma mutação no gene-1 do nematódeo “Caenorhabditis elegans”). Esses genes são conhecidos por estarem associados especificamente a outras funções celulares diferentes do reparo de DNA, mas quando as vias que eles influenciam são seguidas ao seu destino final, foi observado que eles mediam uma das três funções, a saber:
Pontos de controlo de danos no ADN
Quando ocorrem danos no ADN, são ativados os pontos de controlo (checkpoints) do ciclo celular. A ativação dos pontos de controlo para o ciclo celular e dá tempo à célula para reparar os danos antes de esta continuar a dividir-se. Os pontos de controlo de danos no ADN funcionam nos limites entre fase G1/S e fase G2/M. Também existe um ponto de controlo dentro da fase S. A ativação de pontos de controlo é controlada por duas quinases mestras, a ATM e ATR. A quinase ATM responde às quebras de dupla febra do ADN e altera a estrutura da cromatina, enquanto que a ATR responde principalmente à presença de forcadas de replicação paradas. Estas quinases fosforilam alvos situados a jusante numa cascata de transdução de sinais, o que finalmente faz com que o ciclo celular pare. Também se identificou uma classe de proteínas mediadoras do ponto de controlo, como BRCA1, MDC1 e 53BP1. Estas proteínas parecem ser necessárias para transmitir o sinal de ativação do ponto de controlo a proteínas situadas a jusante da via.
A resposta SOS procariota
A Resposta SOS consiste nas alterações na expressão génica que ocorrem em Escherichia coli e outras bactérias em resposta a grandes danos no ADN. O sistema SOS procariota é regulado por duas proteínas chave: LexA e RecA. O homodímero LexA é um repressor transcricional que se liga a sequências operadoras normalmente denominadas caixas SOS. Em Escherichia coli é sabido que LexA regula a transcrição de aproximadamente 48 genes incluindo os genes lexA e recA. A resposta SOS está muito espalhada entre o domínio Bacteria, mas está quase sempre ausente em certos filos bacterianos, como o das espiroquetas. Os sinais celulares mais comuns que ativam as respostas SOS são regiões de ADN de cadeia simples, que se originam em forcadas de replicação paradas ou quebras de dupla febra, que são processadas pela ADN helicase para separar as duas febras do ADN. No passo de iniciação, a proteína RecA liga-se ao ADN de cadeia simples numa reação impulsionada pela hidrólise do $\text{ATP}$, criando filamentos RecA–ADN de cadeia simples. Os filamentos RecA–ADN de cadeia simples ativam a atividade de auto protease de LexA, o que leva finalmente à ocorrência da excisão do dímero LexA, seguida da degradação de LexA. A perda do repressor LexA induz a transcrição dos genes SOS e permite uma indução de sinais, inibição da divisão celular e um aumento dos níveis de proteínas responsáveis pelo processamento dos danos.
Respostas transcricionais eucariotas a danos no ADN
As células eucariotas expostas a agentes que danificam o ADN também ativam vias defensivas importantes ao induzirem muitas proteínas implicadas na reparação do ADN, o controlo do ponto de controlo do ciclo celular e o tráfego e degradação de proteínas. Esta resposta transcricional em todo o genoma é muito complexa e está muito regulada, o que permite uma resposta coordenada aos danos. A exposição de células de leveduras Saccharomyces cerevisiae a agentes que danificam o ADN dá lugar a perfis transcricionais sobrepostos mas diferentes. As semelhanças com a resposta ao choque ambiental indicam que existe uma via de resposta ao stresse global geral a nível de ativação transcricional. Em contraste, diferentes tipos de células humanas respondem aos danos de maneira diferente, o que indica a ausência de uma resposta global comum. A provável explicação desta diferença entre as leveduras e as células humanas pode estar na heterogeneidade das células de mamífero. Num animal, há diferentes tipos de células que estão distribuídas em distintos órgãos nos quais evoluíram diferentes sensibilidades aos danos no ADN.
Reparo de DNA em doença e em envelhecimento
Quando as células ficam velhas, a quantidade de danos de DNA acumula-se de tal forma que se sobrepõe a capacidade de reparo resultando numa redução da síntese proteica. As proteínas nas células são usadas para numerosas funções vitais, as células se tornam gradualmente prejudicadas e posteriormente morrem. Quando células suficientes num órgão chegam até este estado, o órgão por si só se torna comprometido e os sintomas de doença começam a se manifestar. Estudos experimentais em animais, onde genes associados ao reparo de DNA foram silenciados, resultaram na aceleração do envelhecimento, manifestação precoce da idade relativa às doenças e susceptibilidade aumentada ao câncer. Em estudos onde a expressão de certos genes relacionados a reparos de DNA foi aumentado, resultou-se em expectativa de vida expandida e resistência a agentes carcinogênicos em células em cultura.
A taxa de reparo de DNA é variável
Se a taxa de danos no DNA exceder a capacidade da célula em repará-los, o acúmulo de erros pode subjugar a célula e resultar em senescência, apoptose ou câncer, dependendo do número de danos moleculares, quais genes foram atingidos e quais e o número de mecanismos de reparação em atividade. Doenças herdadas associadas à ausência de reparo de DNA funcionante resultam em envelhecimento prematuro (e.g. Síndrome de Werner) e sensibilidade aumentada a carcinógenos (e.g. Xeroderma pigmentosum). Estudos em animais, onde genes de reparo de DNA são impedidos de funcionar, perfis similares dessas doenças são observados. Em outra via, organismos com sistemas melhorados de DNA como a bactéria Deinococus radiodurans (também conhecida por Conan, o Bárbaro a bactéria foi listada no Guiness Book por ser a bactéria mais resistente já conhecida, conseguindo resistir a dosagens de radiação-gama mil vezes mais altas que as letais para seres humanos), exibem resistência notável à radioatividade devido às suas enzimas serem hábeis a conseguir taxas rápidas e incomuns para manter o DNA reparado, mesmo sob altas doses de radiação gama, e devido a isso, ela possui consigo 10 cópias de seu genoma. Em humanos, centenários japoneses tem sido achados como tendo em comum o genótipo mitocondrial, o qual os predispõem a reduzir os danos em DNA mitocondrial nessas organelas. Estudos em fumantes têm indicado que pessoas com mutação têm em suas causas a menor expressão de um poderoso reparo de DNA associado ao gene hOGG1, a vulnerabilidade a câncer do pulmão e a outros casos de câncer tem aumentado. Polimorfismos simples de nucleotídeos (em inglês, SNP - Single nucleotide polymorphism) associados com essa mutação podem ser clinicamente detectados.
Desordens crônicas do reparo de DNA
Doenças crônicas podem ser associados com aumento dos danos no DNA. Por exemplo, a fumaça do cigarro causa danos oxidativos ao DNA e outros componentes de células do coração e fígado, resultando na formação de adultos de DNA (moléculas que destroem o DNA). Danos no DNA podem agora serem mostrados como fator causal de doenças que variam desde arteriosclerose até o mal de Alzheimer, onde pacientes tem menor capacidade de reparo de DNA nas células nervosas. Danos no DNA mitocondrial podem também estar implicados em numerosas doenças.
Taxas de reparos de DNA desempenham um papel vital na escala celular de doenças (não-infecciosas), envelhecimento e na escala evolucionária populacional. Duas importantes relações foram estabelecidas: Como mutação está diretamente relacionada à evolução, um novo modo de observação dessa relação entre evolução e envelhecimento emerge. É aparente que todos os mecanismos de mutação provêem o genoma à plasticidade a adaptação, e é também responsável por desestabilizá-lo fazendo-o, assim, vulnerável ao envelhecimento e a doenças. São organismos sujeitos a doença e ao envelhecimento primariamente porque a mutação é o guia primário da evolução? Essas questões permanecem numerosas e contendedoras que as teorias sobre o envelhecimento têm oferecido.
Um vasto número de evidências correlaciona danos de DNA à morte e às doenças. Como indicado por novos estudos sobre superexpressão, o aumento da atividade de algumas enzimas de reparo de DNA pode diminuir a taxa de envelhecimento e doença. Esse modo resulta num desenvolvimento de intervenções que podem adicionar muitos anos saudáveis e livres de doenças ao envelhecimento populacional. Nem todas as enzimas de reparo de DNA são benéficas quando seus genes estão superexpressos, porém. Algumas enzimas de reparo de DNA podem introduzir novas mutações no DNA sadio. Reduzida especificidade de substrato bioquímico pode estar implicado nesses erros.
Procedimentos tais como a quimioterapia e a radioterapia agem para sobrepujar a capacidade de reparo de DNA celular para resultar na morte celular. Células que são capazes de se dividirem rapidamente, assim como o câncer, são preferencialmente afetadas. Esse efeito colateral é que outras células não-cancerosas, mas de capacidade de divisão similar, assim como as células-tronco em medula óssea também são afetadas. Modernos tratamentos de câncer tentam localizar o dano no DNA de células e tecidos somente associados a câncer.
Para usos terapêuticos do reparo de DNA, o desafio é descobrir particularmente quais enzimas de reparo de DNA que exibem maior especificidade para locais de dano, então a superexpressão irá levar à melhora da função de reparo de DNA. Uma vez que fatores apropriados de reparo têm sido identificados, o próximo passo é selecionar a via apropriada para entregar às células, para gerarem tratamentos viáveis de doenças e envelhecimento. O desenvolvimento de “genes espertos”, os quais são hábeis em alterar a quantidade de proteínas por eles expressas baseadas na mudança de condições celulares, objetiva o aumento da eficácia do reparo de DNA e das argumentações sobre essa revolucionária terapêutica.
Ao contrário, múltiplos mecanismos endógenos de reparo de DNA, reparo gênico ou correção gênica, referem-se à forma de uma terapia gênica, a qual precisamente objetiva e corrige mutações cromossômicas responsáveis por desordens. É feito então pela troca da sequência quebrada de DNA com a sequência desejada, usando técnicas tais como mutagênese dirigida a oligonucleotídeos. Mutações genéticas requerem reparos são normalmente herdados, mas, em alguns casos, eles podem ser induzidos ou adquiridos (assim como o câncer).
Desordens hereditárias no reparo de DNA
Defeitos no mecanismo de reparação são responsáveis por muitas desordens genéticas, incluindo: Retardo mental frequentemente acompanha as últimas desordens, sugerindo aumento na vulnerabilidade dos neurônios em desenvolvimento. Outras desordens do reparo de DNA incluem: As doenças acima são frequentemente chamadas de “progerias segmentais” (doenças do envelhecimento precoce) porque suas vítimas aparentam ser anciãs e sofrem de doenças relacionadas ao envelhecimento numa idade que são muito mais novas do que elas de fato aparentam ser. Outras doenças associadas com redução do reparo do DNA são anemia de Fanconi, câncer de seio e de cólon hereditários.
Os processos básicos de reparo de DNA são altamente conservativas entre os procariotos e eucariotos e até nos fagos (vírus que infetam bactérias); como também, grande quantidade de organismos, genomas e mecanismos de reparo complexos. A habilidade de catalisar numerosas proteínas nas estruturas principais para relevantes reações químicas tem dado um papel significativo na elaboração de mecanismos de reparo durante a evolução. Os fósseis indicam que uma única célula viva principiava a proliferação no planeta, em algum momento durante o período pré-cambriano, embora não se reconheça quando a primeira vez que a vida moderna surgiu. Os ácidos nucleicos passaram a ser as únicas organelas a codificar a informação genética, requerendo mecanismos de reparo de DNA que em sua forma básica têm sido herdados pela todas as formas de vida existentes por seus ancestrais semelhantes. A emergente atmosfera terrestre rica em oxigênio (conhecida como "grande evento de oxigenação") devido aos organismos fotossintetizantes, como também a presença de potenciais danos por radicais livres na célula devido à fosforilação oxidativa, necessitavam evoluir os mecanismos de reparo DNA que atuam especialmente para combater os tipos de danos induzidos por estresse oxidativo.
Velocidade das alterações evolutivas
Em algumas situações, os danos de DNA não são reparados, ou é reparado por um mecanismo propenso a erros que resultam em uma alteração segundo a sequência original. Quando isto acontece, a mutação pode propagar dentro dos genomas da progenia da célula. Tal acontecimento deve em uma linha germinal celular que pode eventualmente produzir um gameta, a mutação tem o potencial de ser passado para o organismo descendente. A velocidade das evoluções nas espécies em particular (ou, em um gene em particular) é uma função da taxa de mutação. Como uma conseqüência, a velocidade e a precisão dos mecanismos de DNA influenciam sobre os processos de mudança evolucionária.
